Moving-average-imagej

Moving-average-imagej

Scottrade-options-trading-fees
Perdagangan-sinyal-kse
Online-share-trading-nse-bse


Moving-averages-time-series-data-analysis Trading-item-in-dc-universe-online Moving-average-trading-rule-to-test Online-trading-hong-kong Teknik-forex-sebenar-v3-pdf Online-trading-diary

Image Intensity Processing Kecerahan adalah persepsi visual cahaya yang dipantulkan. Kecerahan yang meningkat mengacu pada gambar yang meningkatkan luminance. Kontras adalah pemisahan bagian yang paling terang dan paling gelap dari sebuah gambar. Peningkatan kontras akan menggelapkan bayangan dan menyoroti sorotan. Meningkatnya kontras umumnya digunakan untuk membuat objek dalam gambar lebih bisa dibedakan. Sesuaikan kecerahan dan kontras dengan Image Adjust BrightnessContrast. Untuk membuat visualisasi gambar lebih mudah. Tekan tombol Auto untuk menerapkan peregangan kontras cerdas ke tampilan gambar. Kecerahan dan kontras disesuaikan dengan memperhatikan histogram gambar. Jika ditekan berulang kali, tombol akan meningkatkan persentase piksel jenuh. Tombol Reset membuat angka maksimum 0 dan 255 minimum dalam gambar 8-bit dan nilai minimum dan minimum sama dengan nilai piksel terkecil dan terbesar dalam gambar histogram untuk gambar 16-bit. Jika tombol Auto tidak menghasilkan hasil yang diinginkan, gunakan alat minat daerah (ROI) untuk memilih bagian sel dan beberapa latar belakang, lalu tekan tombol Auto lagi. Peregangan kemudian akan didasarkan pada intensitas ROI. Menekan tombol Apply secara permanen akan mengubah nilai abu-abu sebenarnya dari gambar. Jika hanya menganalisa intensitas gambar jangan menekan tombol ini. Jika Anda lebih memilih gambar yang akan ditampilkan sebagai warna hitam putih daripada putih pada warna hitam, gunakan perintah terbalik: Tabel Lookup Gambar Balikkan Lut. Perintah Edit Invert membalikkan nilai pixel itu sendiri secara permanen. Mendapatkan nilai intensitas dari ROI tunggal Jika bekerja dengan stack, ROI yang dipilih dapat dianalisis dengan perintah: Image Stacks Plot Z Axis Profile. Ini menghasilkan satu kolom angka - satu irisan intensitas per baris. 6 baris teratas kolom adalah rincian ROI. Ini memastikan ROI yang sama tidak dianalisis dua kali dan memungkinkan Anda untuk menyimpan ROI yang menarik. Rinciannya terdiri dari area, koordinat x, y-koordinat, AR, kebulatan, dan soliditas ROI. Jika ROI adalah ROI polylinegtfreehand daripada squaregtoval, ia bertindak seolah-olah ROI adalah ovalgtsquare. ROI (oval) dapat dipulihkan dengan memasukkan rincian yang diminta oleh perintah Edit Selection Restore Selection (hotkey: Ctrl Shift E). Hasilnya ditampilkan di jendela plot dengan rincian ROI pada judul jendela plot. Plot berisi tombol Daftar, Simpan, Salin. Tombol Copy menempatkan data di clipboard sehingga bisa disisipkan ke dalam lembar Excel. Pengaturan untuk tombol salin dapat ditemukan di bawah Opsi Pilihan Edit Profil Plot. Pengaturan yang disarankan meliputi: Jangan simpan nilai x (mencegah data jumlah slice disisipkan ke Excel) dan Autoclose sehingga Anda tidak perlu menutup plot yang dianalisis setiap saat. Dynamic intensity vs Time analysis Plugin Plot Z Axis Profile (ini adalah Z Profiler dari Kevin (Gali) Baler (gliblr at yahoo) dan Wayne Rasband namanya saja) akan memantau intensitas ROI yang bergerak dengan menggunakan alat pelacak partikel. Alat ini bisa manual atau otomatis. Gunakan perintah Image Stacks Plot Z Axis Profile. Mendapatkan nilai intensitas dari beberapa ROI Anda dapat menganalisis beberapa ROI sekaligus dengan plugin Bob Doughertys Multi Measure. Fungsi manajer ROI asli melakukan pekerjaan serupa kecuali doesnt menghasilkan hasil dalam kolom yang diurutkan. Periksa situs web Bobs untuk mendapatkan pembaruan. Plugin Multi Measure yang disertakan dengan instalasi v3.2. Buka confocal-series dan hapus latar belakangnya (Lihat koreksi Latar Belakang) Buat tumpukan referensi untuk penambahan ROI. Gunakan fungsi Tumpukan Gambar Tumpukan dan pilih Rata-rata. Ubah nama gambar ini menjadi sesuatu yang berkesan. Buka plugin Manajer ROI (Analyze Tools Roi Manager atau ikon toolbar). Pilih ROIs dan Add to the ROI manager. Klik tombol Tampilkan Semua untuk membantu menghindari analisis sel yang sama dua kali. Setelah memilih ROI untuk dianalisis dalam gambar referensi, Anda dapat menarik mereka ke gambar referensi dengan mengklik tombol Moregtgt dan memilih Draw. Simpan gambar referensi ke folder data eksperimen dan kemudian klik pada tumpukan yang akan dianalisis. Klik tombol Moregtgt di manajer ROI dan pilih tombol Multi Measure untuk mengukur semua ROI. Klik Ok Ini akan menempatkan nilai dari masing-masing slice ke satu baris dengan beberapa kolom per slice. Mengklik Ukur semua 50 irisan akan menempatkan semua nilai dari semua irisan dan setiap ROI dalam satu kolom. Buka jendela Results dan pilih item menu Edit Select All. . Lalu EditCopy. Pergi ke Excel dan paste di data. Periksa apakah semuanya telah disisipkan dengan benar 10. Untuk menyalin koordinat ROI ke dalam spreadsheet Excel, perlu ada baris kosong di atas data intensitas. Gunakan dialog Multi Measure dan klik tombol Copy list. 14. Di Excel, klik sel kosong di atas kolom data pertama dan tempelkan koordinat ROI. Simpan ROI dengan tombol Multi Measure Save. Masukkan mereka ke folder data eksperimen. ROI dapat dibuka nanti baik secara individual dengan tombol Open atau sekaligus dengan tombol Open All. ROI oval dan persegi panjang dapat dipulihkan secara terpisah dari nilai x, y, l, h dengan ROI Plugins Tentukan ROI. perintah. Ratiometric imaging membandingkan rekaman dua sinyal yang berbeda untuk melihat apakah ada kesamaan di antara keduanya. Hal ini dilakukan dengan membagi satu saluran dengan saluran lain untuk menghasilkan kanal ratiometrik ketiga. Teknik ini berguna karena mengoreksi kebocoran zat warna, pemuatan zat warna yang tidak merata, dan pemutihan foto. Contoh aplikasi akan mengukur ion intraseluler, pH, dan dinamika tegangan secara real time. Pengurangan latar belakang diperlukan sebelum analisis citra rasio dual-channel. Lihat juga bagian koreksi latar belakang. Plugin RatioProfiler akan melakukan analisis ratiometrik ROI tunggal pada tumpukan interleaved saluran ganda. Irisan ganjil adalah gambar saluran 1 dan bahkan irisan adalah gambar saluran 2. Jika dua saluran Anda dibuka sebagai tumpukan terpisah, seperti Zeiss, kedua saluran dapat disisipkan (digabungkan bersamaan dengan bergantian di antara keduanya) dengan perintah menu Plugins Stacks - Shuffling Stack Interleaver. Plugin akan menghasilkan plot hijau dari nilai rasio. Ch1Ch2 adalah default dan Anda bisa mendapatkan Ch2Ch1 jika plugin dijalankan dengan tombol Alt ke bawah. Ini juga akan menghasilkan alur kedua dari intensitas masing-masing saluran, Ch1 dan Ch2, serta tabel hasil. Baris pertama tabel hasil berisi nilai untuk x, y, lebar dan tinggi ROI. Dari baris kedua ke bawah, kolom pertama adalah waktu (nomor slice), kolom kedua adalah intensitas rata-rata Ch1, dan kanal ketiga adalah intensitas rata-rata Ch2 dan nilai rasionya. Tumpukan harus memiliki interval frame yang dikalibrasi agar nilai Time berada dalam hitungan detik. Jika tidak, itu adalah irisan. Interval frame dapat diatur untuk stack melalui perintah menu Image Properties. Tabel ini dapat disalin ke clipboard dan disisipkan di tempat lain dengan perintah Edit Copy All menu. Analisis Rasio Dengan menggunakan manajer ROI 1. Ekstrak latar belakang dari gambar. 2. Buka manajer ROI (Menganalisis Tools ROI manager.) Dan klik tombol Show All. 3. Pilih sel yang akan dianalisis dan tambahkan ke manajer ROI (tombol Add atau tombol keyboard T). 4. Jalankan plugin. Jendela hasil berisi mean ch1 dan ch2 dan rasionya. Setiap baris adalah timepoint (slice). Baris pertama berisi rincian ROI. Untuk menghasilkan gambar referensi: Ratakan tumpukan dengan perintah menu (Image Stacks Z-project dengan tipe Proyeksi: Maksimum), Sesuaikan kecerahan dan kontras jika perlu. Pilih gambar baru dan klik tombol More di manajer ROI. Setelah itu pilih Label. Mendapatkan data timestamp The LSM Toolbox adalah sebuah proyek yang bertujuan mengintegrasikan fungsi umum yang berguna di seputar format file LSM Zeiss, yang seharusnya meningkatkan kegunaan file LSM confocal yang tersimpan dalam format aslinya, sehingga melestarikan semua metadata yang ada. Di Fiji, perintah yang sesuai adalah: File Import Show LSMToolbox yang menampilkan toolbox, dari mana semua perintah dapat dipanggil dan Help About Plugins LSMToolbox. Yang menampilkan informasi tentang plugin. Pembacaan ini bisa ditemukan dengan menggunakan perintah menu Image Show Info. . Gulir ke bawah untuk mendapatkan waktu setiap irisan diperoleh. Pilih waktu ini, salin ke Excel, dan cari nomor waktu yang didapat dengan menggunakan perintah menu Excel Edit Replace. Ini hanya akan menyisakan waktu data. Waktu yang telah berlalu kemudian dapat dihitung dengan mengurangkan baris 1 dari semua baris berikutnya. Linescanning melibatkan perolehan satu baris, satu piksel lebarnya, dari mikroskop confocal umum, bukan gambar 2D standar. Ini biasanya cara yang lebih cepat untuk mengambil gambar. Semua gambar single pixel-wide kemudian ditumpuk untuk menciptakan gambar 2D. Generasi pseudo-linescan dari gambar 3-D (x, y, t). Hal ini berguna untuk menampilkan data 3-D dalam 2 dimensi. Sebuah garis bunga ditarik diikuti oleh perintah: Image Stacks Reslice atau dengan tombol keyboard. Ini akan menanyakan lebar garis yang ingin Anda rangkum. Ini akan menghasilkan tumpukan pseudo-linescan dengan setiap irisan yang mewakili pseudo-linescan dari garis lebar satu piksel sepanjang garis bunga. Rata-rata tumpukan pseudo-lines dapat dipilih dengan memilih Image Stacks Z-Project. Dan gunakan perintah Average. Sebuah poli-line dapat digunakan, tapi ini hanya akan menghasilkan satu irisan piksel tunggal. Pengaturan default Fijis berasumsi bahwa tumpukan adalah z -series dan bukan t -series. Ini berarti bahwa banyak fungsi yang berkaitan dengan dimensi ketiga dari tumpukan gambar disebut dengan z-. Ingatlah ini. FRAP (Analisis Fluoresensi Setelah Memotretkan) Analisis plugin profiler FRAP akan menganalisis intensitas ROI yang dikelantang dari waktu ke waktu dan menormalkannya terhadap intensitas keseluruhan sel. Setelah itu akan menemukan intensitas minimum ROI yang dikelantang dan sesuai dengan pemulihan dengan pemikiran ini. Buka pengelola ROI. Gambarlah sekitar ROI yang dikelantang dan tambahkan ke manajer ROI. Gambarlah seluruh sel dan tambahkan itu ke manajer ROI. Normalisasi mengoreksi pemutihan yang terjadi selama perolehan gambar dan mengasumsikan keseluruhan sel berada di bidang pandang. Plugin mengasumsikan yang lebih besar dari dua ROI di manajer ROI adalah keseluruhan ROI sel dan ROI yang lebih kecil adalah bagian yang dikelantang. Jalankan plugin profiler FRAP. Plugin akan mengembalikan intensitas vs plot waktu, intensitas waktu yang dinormalisasi vs plot waktu area yang dikelantang, dan kurva yang sesuai. Kontras kontras non-linier Persamaan Anda dapat memiliki kontrol yang lebih besar terhadap penyesuaian kecerahan dan kontras dengan perintah menu Proses Enhance contrast. Dengan setumpuk, ia menganalisis setiap histogram irisan untuk membuat penyesuaian. Perintah kontras Equalize menerapkan histogram non linier histogram berdasarkan akar kuadrat dari intensinya. Gamma melakukan penyesuaian histogram non linier. Benda samar menjadi lebih intens sedangkan objek terang tidak (gamma lt1). Selain itu, objek dengan intensitas menengah menjadi redup sedangkan objek terang tidak (gamma gt 1). Intensitas masing-masing pixel dinaikkan ke kekuatan nilai gamma dan kemudian diskalakan menjadi 8-bit atau min dan max dari gambar 16 bit. Untuk gambar 8 bit Intensitas baru 255 (intensitas cahaya255) gamma Gamma dapat disesuaikan melalui perintah Gamma Proses Matematika. Ini akan memungkinkan Anda untuk menyesuaikan gamma dengan scroll bar. Klik Ok setelah selesai. Anda dapat menggunakan Gulir-bar untuk menentukan nilai gamma yang diinginkan pada satu irisan tumpukan Anda. Ada juga pilihan untuk melihat pratinjau hasilnya. Lihat referensi online untuk penjelasan tentang filter digital dan bagaimana penggunaannya. Filter dapat ditemukan dengan menggunakan perintah menu Process Filters. . Filter berarti Pixel diganti dengan rata-rata dirinya dan tetangganya dalam radius yang ditentukan. Item menu Process Smooth adalah 33 mean filter. Gaussian filter Ini mirip dengan filter pemulusan namun menggantikan nilai piksel dengan nilai sebanding dengan distribusi normal tetangganya. Filter median Nilai pixel diganti dengan median itu sendiri dan tetangga yang berdekatan. Ini menghilangkan kebisingan dan menjaga batas lebih baik daripada penyaringan rata-rata sederhana. Item menu Process Noise Despeckle adalah 33 median filter. Convolve filter: Hal ini memungkinkan dua susunan angka untuk dikalikan bersama. Array dapat ukuran berbeda tetapi harus memiliki dimensi yang sama. Dalam analisis citra, proses ini umumnya digunakan untuk menghasilkan citra keluaran dimana nilai piksel merupakan kombinasi linear dari nilai input tertentu. Minimum: Filter ini, juga dikenal sebagai filter erosi, adalah filter morfologi yang mempertimbangkan lingkungan sekitar piksel dan, dari daftar tetangga ini, menentukan nilai minimum. Setiap pixel pada gambar tersebut kemudian diganti dengan nilai yang dihasilkan oleh masing-masing lingkungan. Maksimum: Filter ini, yang juga dikenal sebagai filter pelebaran, adalah filter morfologi yang mempertimbangkan lingkungan sekitar setiap piksel dan, dari daftar tetangga ini, menentukan nilai maksimum. Setiap pixel pada gambar tersebut kemudian diganti dengan nilai yang dihasilkan oleh masing-masing lingkungan. Filter Kalman Filter ini, yang juga dikenal sebagai Estimasi Kuadrat Linear, beroperasi secara rekursif pada input yang bising untuk menghitung perkiraan kondisi sistem yang mendasar secara statistik. Koreksi latar belakang bisa dilakukan dengan berbagai cara. Metode sederhana adalah dengan menggunakan Tabel Gambar Lookup HiLo LUT untuk menampilkan nilai nol sebagai nilai biru dan putih (nilai piksel 255) sebagai warna merah. Dengan latar belakang yang relatif bahkan di seluruh gambar, keluarkan dengan perintah BrightnessContrast dengan perlahan menaikkan nilai Minimum sampai sebagian besar latar belakang ditampilkan biru. Tekan tombol Apply untuk membuat perubahan permanen. Koreksi latar belakang Rolling-Ball Untuk memperbaiki latar belakang yang tidak rata gunakan perintah menu Process Subtract background. Ini akan menggunakan algoritma rolling ball pada latar belakang yang tidak rata. Jari-jarinya harus diatur setidaknya seukuran objek terbesar yang bukan bagian dari latar belakang. Hal ini juga dapat digunakan untuk menghilangkan latar belakang dari gel dimana latar belakang berwarna putih. Menjalankan perintah beberapa kali bisa menghasilkan hasil yang lebih baik. Pengguna dapat memilih apakah memiliki latar belakang yang terang atau tidak, membuat latar belakang tanpa pengurangan, memiliki paraboloid geser, menonaktifkan smoothing, atau melihat pratinjau hasilnya. Nilai default untuk radius bola bergulir adalah 50 piksel. Proses Mengurangi Latar Belakang. Patologi Tatal Menginduksi Kerusakan Neuron Istimewa, Disfungsi Sel Grid, dan Defisit Memori Spasial Mengingatkan Penyakit Alzheimer Awal Hongjun Fu 1.4 Gustavo A. Rodriguez 1.4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4,. Karen E. Duff 1,2,3,5,. 1 Taub Institute for Research on Alzheimers Disease and the Aging Brain, Pusat Kesehatan Universitas Columbia, New York, NY 10032, AS 2 Departemen Patologi dan Biologi Sel, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, AS 3 Departemen Integratif Neuroscience , Institut Psikiater New York State, New York, NY 10032, USA Diterima pada 20 Juli 2016. Direvisi pada 20 Oktober 2016. Diterima pada tanggal 15 Desember 2016. Telah tersedia secara online 19 Januari 2017. Diterbitkan: 19 Januari 2017 Ikhtisar Tau patologi menginduksi defisit memori spasial yang lama , Tapi tidak muda, tikus EC-Tau Tikus Aged EC-Tau menunjukkan hipoaktivitas sel grid dan mengurangi periodisitas. Runtutan, tapi tidak menghambat, neuron MEC rentan terhadap patologi tau Aktivitas neuron yang berubah berkorelasi dengan neurodegenerasi pada EC-Tau tua Tahap awal Alzheimer Penyakit (AD) ditandai dengan terbentuknya kusut dewasa di korteks dan disorientasi dan kebingungan saat menavigasi tempat yang familier. Korteks entorhinal medial (MEC) berisi neuron khusus yang disebut sel grid yang merupakan bagian dari sistem navigasi spasial. Di sini kita menunjukkan pada model tikus transgenik yang mengekspresikan manusia mutan yang paling banyak didengar di Komisi Eropa bahwa pembentukan kusut dewasa pada tikus tua dikaitkan dengan hilangnya sel rangsangan dan defisit dalam fungsi sel grid, termasuk bidang grid yang tidak stabil dan tingkat tembak yang rendah, serta Mengubah aktivitas jaringan Overt tau patologi pada tikus umur tersebut disertai dengan defisit memori spasial. Oleh karena itu, patologi tau yang dimulai di korteks entorhinal dapat menyebabkan defisit dalam penembakan sel grid dan mendasari kemerosotan kognisi spasial yang terlihat pada manusia AD. Tau patologi Penyakit Alzheimer sel korteks entorhinal grid neuronal loss defisit kognitif neurofibrillary kusut memori spasial elektrofisiologi hipoaktivitas Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4.November 04, 2010 Informasi berikut adalah versi terbaru dari metode untuk menggunakan ImageJ untuk menganalisis barat Noda dari halaman lama yang sudah usang. Jika Anda mencari opsi alur kerja yang lebih komprehensif untuk analisis western blot Anda, silakan kunjungi tutorial saya tentang cara menggunakan Image Studio Lite. Sebuah paket perangkat lunak bebas dari LI-COR Biosciences. Perangkat lunak Image Studio Lite dapat didownload secara gratis dari licorislite. Selain fungsi yang dijelaskan di bawah ini untuk ImageJ, Image Studio Lite menyediakan fitur pengelolaan data tambahan beserta anotasi alat untuk menghasilkan gambar siap publikasi dari western Anda. ImageJ (rsb.info.nih.govijindex.html) dapat digunakan untuk membandingkan densitas (aka intensitas) band pada gel agar atau western blot. Tutorial ini mengasumsikan bahwa Anda telah membawa gel atau blot Anda melalui langkah visualisasi, sehingga Anda memiliki citra digital gel Anda di .tif. Jpg Png atau format gambar lainnya (format 16 bit .tif adalah format pilihan untuk menyimpan jumlah maksimum informasi dalam gambar asli). Jika Anda memindai film x-ray pada pemindai flatbed, pastikan Anda menggunakan pemindai dengan kemampuan memindai transparansi (misalnya film), dan gunakan perangkat lunak pemindai untuk menyimpan gambar tiff 16-bit. Lihat referensi di akhir tutorial ini untuk pembahasan berbagai cara agar Anda bisa mengimbangi langkah ini. Ini juga mengasumsikan bahwa Anda tidak memotret gambar blot Anda saat Anda memproduksinya. Untuk penjelasan mengapa overexposure akan merusak hasil Anda, lihat halaman ini. Metode yang diuraikan di sini menggunakan metode Analisis Gel yang digariskan dalam dokumentasi ImageJ: Analisis Gel. Anda mungkin lebih suka menggunakannya daripada metode yang saya garis bawahi di bawah ini. Harus ada sedikit perbedaan antara hasil yang didapat dari berbagai metode. Versi tutorial ini dibuat dengan menggunakan ImageJ 1.42q pada instalasi Windows 7 64-bit. 1. Buka file gambar menggunakan FilegtOpen di ImageJ. 2. Rutin analisa gel mengharuskan gambar menjadi gambar berskala abu-abu. Metode paling sederhana untuk mengkonversi ke grayscale adalah pergi ke ImagegtTypegt8-bit. Gambar Anda akan terlihat seperti Gambar 1. Gambar 1. Gambar blot barat yang dibuat dibuka di ImageJ. Informasi di sepanjang bagian atas gambar menunjukkan bahwa gambar saat ini dalam mode 8-bit, menggunakan LUT pembalik (tabel tampilan). LUT pembalik memastikan bahwa pita gelap akan dicatat sebagai nilai kerapatan yang lebih tinggi. 3. Pilih alat Rectangular Selections dari toolbar ImageJ. Gambarlah sebuah persegi panjang di sekitar jalur pertama. ImageJ mengasumsikan bahwa jalur Anda berjalan secara vertikal (sehingga masing-masing band horizontal), sehingga persegi panjang Anda harus tinggi dan sempit untuk dilampirkan jalur tunggal. Jika Anda menggambar persegi panjang yang pendek dan lebar, ImageJ akan beralih ke asumsi jalur yang berjalan secara horizontal (masing-masing band vertikal), yang menyebabkan banyak kebingungan. Gambar 2. Jalur pertama telah dipilih dengan alat Rectangular Selections 4. Setelah menggambar persegi panjang di atas jalur pertama Anda, tekan tombol 1 (Command 1 on Mac) (Command 1 on Mac) atau masuk ke AnalyzegtGelsgtSelect First Lane untuk mengatur Persegi panjang di tempat Jalur pertama sekarang akan disorot dan ada 1 di tengahnya. 5. Gunakan mouse anda untuk mengklik dan tahan di tengah persegi panjang pada jalur 1 dan seret ke jalur berikutnya. Anda juga bisa menggunakan tombol panah untuk menggerakkan persegi panjang, meski ini lebih lambat. Pusat persegi panjang di atas jalur kiri-ke-kanan, tapi jangan khawatir tentang melapisinya dengan sempurna pada sumbu vertikal yang sama. Image-J secara otomatis akan menyelaraskan persegi panjang pada sumbu vertikal yang sama dengan persegi panjang pertama pada langkah berikutnya. 6. Tekan 2 (Command 2 on Mac) atau masuk ke AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane untuk mengatur persegi panjang di tempat di atas jalur kedua. A 2 akan muncul di jalur saat persegi panjang ditempatkan. 7. Ulangi Langkah 5 6 untuk setiap jalur berikutnya pada gel, tekan 2 (Command 2 on Mac) setiap kali mengatur persegi panjang pada tempatnya (Gambar 3). Gambar 3. Letakkan persegi panjang di atas masing-masing jalur, tekan 2 setiap kali untuk mengatur persegi panjang pada tempatnya. 8. Setelah Anda mengatur kotak di tempat pada jalur terakhir (dengan menekan 2), tekan 3 (Command 3 on Mac), atau pergi ke AnalyzegtGelsgtPlot Lanes untuk menggambar plot profil dari setiap jalur. Gambar 4. Plot profil dari contoh western blot. 9. Plot profil mewakili kerapatan relatif isi persegi panjang di atas setiap jalur. Segitiga disusun paling atas pada plot profil. Pada contoh gambar western blot, puncak pada plot profil (Gambar 4) sesuai dengan pita gelap pada gambar asli (Gambar 3). Karena ada empat jalur yang dipilih, ada empat bagian dalam plot profil. Puncak yang lebih tinggi merupakan band yang lebih gelap. Puncak yang lebih lebar mewakili band yang mencakup rentang ukuran yang lebih luas pada gel aslinya. 10. Gambar gel asli atau western blots akan selalu memiliki beberapa sinyal latar belakang, jadi puncaknya tidak sampai ke garis dasar plot profil. Gambar 5 menunjukkan puncak dari noda nyata dimana ada beberapa kebisingan latar belakang, sehingga puncaknya melayang di atas garis dasar plot profil. Perlu menutup puncak sehingga kita bisa mengukur ukurannya. Gambar 5. Ubin barat yang sebenarnya sering memiliki beberapa kebisingan latar belakang, sehingga puncaknya tidak sampai ke garis dasar (putih sempurna). 11. Pilih alat seleksi Lurus dari toolbar ImageJ (Gambar 6). Untuk setiap puncak yang ingin Anda analisis dalam plot profil, gambarlah garis di dasar puncak untuk melampirkan puncak (Gambar 5). Langkah ini memerlukan penilaian subyektif dari pihak Anda untuk menentukan di mana puncaknya berakhir dan kebisingan latar belakang dimulai. Gambar 6. Gunakan alat garis lurus untuk menutup dasar setiap puncak bunga. Gambar 7. Puncak dari Gambar 5 ditunjukkan dengan garis yang ditarik melintasi dasar puncak untuk melampirkan area puncak. 12. Perhatikan bahwa jika Anda memiliki banyak jalur yang disorot, jalur selanjutnya akan disembunyikan di bagian bawah jendela petak profil. Untuk melihat jalur ini, tekan dan tahan panel spasi, dan gunakan mouse untuk mengklik dan tarik plot profil ke atas. 13. Saat setiap puncak ditutup di dasar dengan alat seleksi Lurus, pilih alat Wand dari toolbar ImageJ (Gambar 8). Gambar 8. Pilih alat Wand untuk menyoroti setiap puncak minat pada plot profil. 14. Dengan menggunakan spacebar dan mouse, tarik plot profil kembali ke bawah sampai Anda kembali ke jalur pertama. Dengan alat Wand, klik di dalam puncak (Gambar 9). Ulangi ini untuk setiap puncak saat Anda turun dari plot profil. Untuk setiap puncak yang Anda sorot, pengukuran harus muncul di jendela Hasil yang muncul. Gambar 9. Klik di dalam puncak 1 minat dengan alat Wand. Puncaknya harus disorot dan pengukuran harus muncul di jendela Results. 15. Setelah semua puncak disorot, masuk ke AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Label ini masing-masing puncak dengan ukurannya, dinyatakan sebagai persentase dari total ukuran semua puncak yang disorot. 16. Nilai dari jendela Hasil (Gambar 10) dapat dipindahkan ke program spreadsheet dengan memilih EditgtCopy Semua di jendela Hasil. Tempelkan nilainya ke dalam spreadsheet. Gambar 10. Keluaran dari memilih puncak pada plot profil dan memberi label pada puncak. Dalam kasus ini, hasilnya adalah memilih pita atas di masing-masing dari 4 jalur pada contoh western blot dari Gambar 1. Catatan: Jika Anda secara tidak sengaja mengklik salah tempat dengan Wand. Program ini masih mencatat area yang diklik sebagai puncak, dan akan menjadi faktor ke dalam total area yang digunakan untuk menghitung nilai persentase. Jelas ini akan mengurangi hasil Anda jika Anda mengeklik area yang tidak terangkat. Jika Anda kebetulan mengklik di tempat yang salah, cukup masuk ke AnalyzegtGelgtLabel Peaks untuk merencanakan hasil saat ini, yang menampilkan nilai yang salah, namun yang lebih penting me-reset meja untuk jendela Hasil. Kembali ke plot profil dan mulai mengklik di dalam puncak lagi, dimulai dengan puncak 1 minat. Jendela Hasil harus jelas dan mulai menunjukkan nilai baru Anda. Bila Anda benar-benar mengklik semua puncak yang benar tanpa sengaja mengklik area yang salah, Anda dapat kembali ke AnalyzegtGelsgtLabel Peaks dan mendapatkan hasil yang benar. Analisis data Dengan data Anda disisipkan ke dalam spreadsheet, Anda sekarang dapat menghitung kerapatan relatif puncak. Sebagai pengingat, nilai yang dihitung oleh ImageJ pada dasarnya adalah nomor yang sewenang-wenang, mereka hanya memiliki makna dalam konteks himpunan puncak yang Anda pilih pada gambar gel tunggal yang telah Anda kerjakan. Mereka tidak memiliki unit protein atau unit dunia nyata lainnya yang dapat Anda pikirkan. Prosedur normal adalah untuk mengekspresikan kerapatan pita yang dipilih relatif terhadap beberapa band standar yang juga Anda pilih selama proses ini. 1. Letakkan data Anda di spreadsheet. Salah satu puncak harus menjadi standar Anda. Dalam contoh ini kita akan menggunakan puncak pertama sebagai standar. 2. Pada kolom baru di sebelah kolom Persen, bagii nilai Persen untuk setiap sampel dengan nilai Persen untuk standar (puncak pertama dalam kasus ini, 26.666). 3. Kolom nilai yang dihasilkan adalah ukuran kerapatan relatif setiap puncak, dibandingkan dengan standar, yang jelas memiliki kerapatan relatif 1. Gambar 11. Menghitung kerapatan relatif untuk masing-masing dari 4 puncak yang disorot. Kami menggunakan Sampel 1 sebagai standar untuk gel ini. Densitas Relatif dihitung dengan membagi nilai Persen untuk setiap sampel dengan nilai Persen untuk standar. 4. Dalam contoh ini, jalur ke 2 memiliki Densitas Relatif yang lebih tinggi (1,86), yang sesuai dengan ukuran dan kegelapan pita tersebut pada citra asli (Gambar 1). Ingat bahwa data ini untuk baris atas band pada gambar blot asli barat. 5. Jika Anda ingin membandingkan densitas sampel pada beberapa gel atau blot, Anda harus menggunakan sampel standar yang sama pada setiap gel untuk memberi referensi umum saat Anda menghitung nilai Densitas Relatif. Lihat bagian di bawah ini untuk pembahasan lebih rinci mengenai persyaratan ini. 6. Untuk menguji perbedaan yang signifikan antara perlakuan dalam eksperimen, semua gel atau blot Anda perlu dipindai dan dihitung dengan menggunakan metode ini, dan nilainya akan dinyatakan dalam istilah Relative Density, atau Anda dapat mengobati Densitas Relatif. Sebagai nilai perubahan lipat (yaitu perbedaan Densitas Relatif 2 antara kontrol dan perlakuan akan menunjukkan perubahan ekspresi 2 kali lipat). Jika Anda akan menggunakan analisis teknik varians untuk menguji data Anda, Anda mungkin perlu memastikan bahwa nilai Densitas Relatif Anda terdistribusi normal dan ada homogenitas varians di antara perlakuan yang berbeda. 7. Perlu dicatat di sini bahwa beberapa peneliti membuat usaha ekstra untuk memasukkan serangkaian pengenceran serial dengan standar yang telah diketahui pada masing-masing noda. Dengan menggunakan kurva pengenceran serial dan teknik kuantifikasi yang diuraikan di atas, Anda dapat mengekspresikan sampel band Anda dalam hal picogram atau nanogram protein. Contoh yang lebih terlibat dengan menggunakan kontrol pemuatan. Kami akan menggunakan Gambar 12 sebagai blangko barat yang representatif. Pada noda ini, kita akan berpura-pura bahwa kita memasukkan empat sampel tiruan protein (empat lembar pipet keluar dari botol homogenat yang sama), jadi kita berharap kepadatan di setiap jalur menjadi setara. Baris atas batang akan mewakili protein kita yang diminati. Serangkaian bar yang lebih rendah akan mewakili protein pemuatan muatan kami, yang dimaksudkan untuk memastikan jumlah protein total yang sama dimuat di setiap jalur. Protein pemecah muatan ini adalah protein yang diduga diekspresikan pada tingkat konstan tanpa mempedulikan perlakuan yang diterapkan pada organisme asli, seperti aktin (walaupun banyak orang akan mempertanyakan pernyataan bahwa aktin akan dinyatakan secara ekuivalen di seluruh perawatan). Gambar 12. Contoh western blot dengan baris yang lebih rendah dari band kontrol pemuatan. Seringkali band ini akan mewakili protein yang dianggap diekspresikan secara ekuivalen pada semua perawatan, seperti aktin. Melihat Gambar 12, kami berharap dapat memuat jumlah total protein total di setiap jalur, namun setelah menjalankan lapisan barat, ukuran dan intensitas palang bawah di masing-masing jalur sangat bervariasi. Dua jalur kiri tampak setara, namun jalur ke-3 memiliki separuh kerapatan (nilai abu-abu) dibandingkan dengan jalur 12, sedangkan jalur 4 memiliki setengah kerapatan dan setengahnya dibandingkan dengan jalur 12. Karena kontrol pemuatan kita sangat berbeda, kerapatan Nilai dari himpunan atas band mungkin tidak langsung sebanding. Kami menggunakan analisis gel secara rutin untuk mengukur kerapatan dan ukuran potongan, dan menggunakan hasil dari kontrol pemuatan kami (pita bawah) untuk mengukur nilai protein yang kami minati (pita atas). 1. Buka gambar blot barat di ImageJ. 2. Pastikan gambar dalam mode 8-bit: pergi ke ImagegtTypegt8-bit. 3. Gunakan alat persegi panjang untuk menggambar kotak di sekitar lajur keseluruhan (kedua bilah atas dan bawah disertakan. 4. Tekan 822018221 (atau Command 1 pada Mac) untuk mengatur persegi panjang. 822018221 harus muncul di tengah persegi panjang. 5. Klik dan tahan di tengah persegi panjang dan seret ke jalur 2. 6. Tekan 822028221 (Command 2 on Mac) untuk mengatur persegi panjang untuk jalur 2. Sebuah 822028221 akan muncul di tengah persegi panjang. Ulangi langkah 5 6 untuk setiap jalur berikutnya, tekan 822028221 (Command 2 on Mac) untuk mengatur persegi panjang di atas setiap jalur berikutnya (lihat Gambar 13). Gambar 13. Setiap jalur telah dipilih dengan menggerakkan persegi panjang di atasnya dan menekan 822028221 untuk mengatur Persegi empat di tempat 8. Bila Anda telah menempatkan jalur terakhir (dan menekan 822028221 untuk memasangnya di tempat), Anda dapat menekan 822038221 untuk menghasilkan sebidang jalur yang dipilih (lihat Gambar 14). Gambar 14. Profil plot masing-masing Jalur (diatur dengan jalur 1 di atas, jalur 4 di bagian bawah). Anda mungkin perlu menggulir melalui t Dia melihat semua jalurnya. 9. Plot profil pada dasarnya mewakili nilai kerapatan rata-rata di satu set irisan horizontal masing-masing jalur. Gelap yang lebih gelap akan memiliki puncak yang lebih tinggi, dan lapisan yang menutupi rentang ukuran lebih besar (kD) akan memiliki puncak yang lebih lebar. Dalam contoh western blot kami, band-band itu adalah persegi panjang yang sempurna, namun Anda akan melihat beberapa kemiringan di puncak plot profil, karena ImageJ menerapkan sedikit rata-rata nilai kerapatan saat bergerak dari atas ke bawah setiap jalur. As a result, the sharp transition from perfect white to perfect black on the bands of lane 1 is translated into a slight slope on the profile plot due to the averaging. 10. On our idealized western blot used here, there is no background noise, so the peak reaches all the way down to the baseline of the profile plot. In real western blots, there will be some background noise (the background will not be perfectly white), so the peaks won8217t reach the baseline of the profile plot (see figure 5 above). As a result, each plot will need to have a line drawn across the base of the peak to close it off. 11. Choose the Straight Line selection tool from the ImageJ toolbar. For each peak you want to analyze in the profile plot, draw a line across the base of the peak to enclose the peak (Figure 7). This step requires some subjective judgment on your part to decide where the peak ends and the background noise begins. 12. When each peak of interest is closed off with the straight line tool, switch to the Wand tool. We will use the wand tool to highlight each peak of interest so that Image-J can calculate its relative areadensity. 13. We will start by highlighting the loading-control bands (lower row) on our example western blot. Beginning at the top of the profile plot, use the wand to click inside the 1st peak (Figure 15). The peak should be highlighted after you click on it. Continue clicking on the loading-control peaks for the other lanes. If a lane is not visible at the bottom of the profile plot, hold down the space bar and click-and-drag the profile plot upwards to reveal the remaining lanes. Figure 15. Click inside the loading-control peak with the wand tool. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i.e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i.e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i.e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.
Training-and-development-strategy-model
Investimento-no-mercado-forex